Цикл репликации вич

Проникновение ВИЧ в клетку

CD4 — основной клеточный рецептор для ВИЧ Рецептор CD4 представляет собой мономерный гликопротеин массой 58 кДа, который обна­руживается на поверхности примерно 60% T-лимфоцитов, на поверхности клеток-предше­ственников T-лимфоцитов, находящихся в костном мозге и тимусе, а также на поверхности моноцитов, макрофагов, эозинофилов, дендритных клеток и клеток микроглии ЦНС. Внекле­точный участок рецептора CD4 на T-лимфоцитах состоит из 370 аминокислот; гидрофобный трансмембранный домен состоит из 25 аминокислот, а внутриклеточный участок — из 38 ами­нокислот. Внеклеточный участок содержит четыре иммуноглобулиноподобных домена D1-D4 и область V2 (аминокислоты 40-55), играющую важную роль в присоединении gp120 к CD4. Эта область перекрывается с участком связывания молекул HLA класса II, которые являются естественными лигандами рецептора CD4.

Идентификация участка связывания gp120 на рецепторе CD4 подтолкнула к попыткам исполь­зования свободных молекул CD4 (sCD4) для нейтрализации циркулирующего вируса и пред­отвращения заражения новых клеток. Однако эти попытки не увенчались успехом; несмотря на то, что лабораторные штаммы вируса легко нейтрализовывались sCD4, нейтрализации штам­мов, выделенных непосредственно от больных, добиться не удалось. Более того, оказалось, что sCD4 способны вызывать конформационные изменения внешней оболочки вируса, которые облегчали заражение клеток-мишеней.

Молекулы CD4 соединены с Т-клеточным антигенраспознающим рецепторным комплексом (T-cell receptor, TCR) на поверхности Т-лимфоцитов и связываются с молекулами HLA класса II на поверхности антигенпредставляющих клеток (АПК). Связывание gp120 с CD4 не только служит ключевым моментом в проникновении вируса в клетку, но также нарушает внутрикле­точную передачу сигнала и стимулирует апоптоз лимфоцитов CD4 (Banda, 1992). В последние годы возобновился интерес к идее блокирования рецептора CD4 как основного клеточного ре­цептора для ВИЧ.

PRO542 представляет собой полученный генно-инженерными методами те-травалентный белок слияния CD4-IgG2, который не только подавляет репликацию вируса In vitro, Но и продемонстрировал впечатляющую противовирусную активность у пациентов с вы­сокой вирусной нагрузкой в первых клинических испытаниях (см. главу 6 «АРТ в 2009 году»). 0 том, что молекула CD4 является основным и незаменимым клеточным рецептором для свя­зывания ВИЧ-1, ВИЧ-2 и вируса иммунодефицита обезьян, стало известно уже в 1984 году (Dalgleish 1984).

Однако позже с помощью экспериментов, в которых выполнялась трансфекция человеческого гена CD4 в клеточные линии животных, было установлено, что для проникно­вения ВИЧ в клетку наличия только человеческого рецептора CD4 на ее поверхности недоста­точно. Был сделан вывод о существовании на человеческих клетках дополнительных рецепто­ров — корецепторов, необходимых для проникновения ВИЧ. С другой стороны, было обнаружено, что некоторые лабораторные штаммы ВИЧ-1, а также штаммы ВИЧ-2 и вируса иммунодефицита обезьян могут проникать в клетки, лишенные молекул CD4.

Примечательно, что моноклональные антитела к конформационно измененным в результате взаимодействия с рецептором CD4 эпитопам gp120 связываются также с gp120 CD4-независимых штаммов ви­русов. Это позволило предположить, что у gp120 CD4-независимых штаммов уже есть области, необходимые для распознавания корецепторов и связывания с ними, поэтому связывание с ре­цептором CD4 для проникновения этих штаммов в клетку не обязательно. CD4-независимые штаммы легко нейтрализуются сывороткой ВИЧ-инфицированных, поэтому можно сделать вывод о том, что иммунный ответ препятствует размножению этих штаммов, обеспечивая се­лективный отбор (Edwards, 2001).

Хемокиновые рецепторы — корецепторы для проникновения ВИЧ в клетку Важной вехой в изучении начальной стадии проникновения ВИЧ-1 в клетку стало открытие, сделанное в 1995 г. Cocchi и его коллегами: в совместных культурах лимфоциты CD8, получен­ные от ВИЧ-инфицированных, способны подавлять размножение ВИЧ в аутологичных и ал-логенных лимфоцитах CD4, причем этот эффект не связан с цитотоксической активностью (Levy, 1996). В супернатантах культур лимфоцитов CD8, выделенных от ВИЧ-инфицированных, Cocchi обнаружил хемокины MIP-1a (macrophage inflammatory protein 1a [макрофагальный белок воспаления 1a]), MIP-1P (macrophage inflammatory protein 1P [макрофагальный белок воспаления 1P]) и RANTES (regulated upon activation T cell expressed and secreted [регулируемый процессами активации, экспрессируемый и секретируемый нормальными T-лимфоцитами]); он смог доказать, что эти хемокины способны дозозависимо подавлять репликацию некоторых из исследовавшихся штаммов вируса (Cocchi, 1995).

MIP-1a, MIP-1P и RANTES представляют собой естественные лиганды хемокинового рецептора CCR5. Спустя несколько месяцев после публикации результатов группы Cocchi несколько групп исследователей смогли доказать, что CCR5 служит необходимым корецептором для моноцитотропных (M-тропных) штаммов ВИЧ- 1 (Deng, 1996; Doranz, 1996; Dragic, 1998). Несколькими неделями раньше было опубликовано сообщение о том, что корецептором для T-лимфоцитотропных (T-тропных) штаммов ВИЧ слу­жит хемокиновый рецептор CXCR4 (фузин) (Feng, 1996).

Моноцитотропные (M-тропные) штаммы ВИЧ-1 — это штаммы, которые хорошо размножаются в культурах макрофагов, не способные заражать T-клеточные линии (т. е. «бессмертные» или перевиваемые культуры T-лимфоцитов), однако легко инфицирующие T-лимфоциты, непосредственно выделенные из образцов периферической крови.

T-тропные штаммы, наоборот, хорошо культивируются в T-клеточных линиях и плохо — в макрофагах, но также легко инфицируют T-лимфоциты, не­посредственно выделенные из образцов периферической крови. Таким образом, как M-троп- ные, так и T-тропные штаммы ВИЧ-1 легко заражают выделенные из периферической крови (не «бессмертные») T-лимфоциты человека In vitro. Хемокины (хемоТаксические цитоКины) И их рецепторы изначально были описаны как фак­торы, усиливающие миграцию лейкоцитов (хемотаксис) и их провоспалительную активность. Хемокины представляют собой белки из 68-120 аминокислот; число аминокислот зависит от структуры общего для всех хемокинов цистеинового мотива.

В зависимости от расположения цистеиновых остатков хемокины подразделяются на группы C-X-C (а-хемокины), C-C ф-хемокины) и C-хемокины (у-хемокины). Большинство хемокинов высоко гомологичны между собой по структуре и могут связываться с одними и теми же рецепторами. Рецепторы к хемокинам принадлежат к семейству рецепторов с семью трансмембранными доменами и внут-риклеточно сопряжены с G-белками.

Естественный лиганд хемокинового рецептора CXCR4 — фактор SDF-1 (stromal cell-derived fac-tor-1 [фактор, выделенный из стромальных клеток, 1]). Этот фактор предотвращает проникно­вение T-тропных штаммов ВИЧ-1 в активированные лимфоциты CD4. Хемокины RANTES и макрофагальные белки воспаления MIP-1a и MIP-1J3 являются естественными лигандами ре­цептора CCR5 и способны воспрепятствовать инфицированию T-лимфоцитов M-тропными штаммами ВИЧ-1.

Роль корецепторов показана на рис. 3.4: T-тропные штаммы ВИЧ-1 зара­жают преимущественно активированные Т-лимфоциты CD4 периферической крови и клеточ­ных линий, используя корецептор CXCR4 для проникновения в несущую рецептор CD4 клетку-мишень. M-тропные штаммы способны заражать Т-лимфоциты CD4, моноциты и макрофаги; эти вирусам для проникновения в клетку нужны рецепторы CCR5 и CD4.

Этапы взаимодействия gp120 с клеточными рецепторами сегодня стали более понятны. Глико-протеин gp120 сначала связывается с определенными эпитопами рецептора CD4. После этого gp120 претерпевает конформационные изменения, обеспечивающие более эффективное взаи­модействие его петли V3 с соответствующим корецептором.

От связывания gp120 с корецепто-ром зависит успешность слияния внешней оболочки вируса с клеточной мембраной. Глико-протеин gp41 (трансмембранная часть гликопротеина gp160 внешней оболочки вируса) играет ключевую роль в слиянии внешней оболочки вируса и клеточной мембраны. Предполагается, что gp41 действует подобно гемагглютинину вируса гриппа: после связывания gp120 с рецепто­ром CD4 в gp41 происходят конформационные изменения, в результате которых гидрофобный N-концевой фрагмент gp41 внедряется в мембрану клетки-мишени.

Предположение о том, что gp41 действует наподобие пружинной защелки, было подтверждено с помощью кристаллогра­фического анализа его эктодоменных структур (Chan, 1997). После того, как были расшифро-Рис. 3.4.

Предотвращение проникновения в клетку М-тропных и Т-тропных штаммов ВИЧ путем связы­вания рецепторов хемокинов CCR5 и CXCR4 с их естественными лигандами ваны ключевые для этого процесса аминокислотные последовательности, усилия были направ­лены на синтез пептидов, способных связываться с доменами gp41 и вызывающих конформа-ционные изменения, тем самым предотвращающих слияние внешней оболочки вируса с кле­точной мембраной. T-20 первым из пептидов, связывающихся с gp41, прошел клинические испытания, в которых оценивалась эффективность подавления репликации вируса (см. главу 6 «АРТ в 2009 году»).

В настоящее время Т-20 уже используется для лечения пациентов с симптоматическим течением ВИЧ-инфекции. К недостаткам препарата относится невозможность приема внутрь; препарат вводится подкожно два раза в сутки. С помощью трансфекций клеточных линий были выявлены и другие хемокиновые рецепторы, которые наряду с CCR5 и CXCR4 служат корецепторами для некоторых штаммов ВИЧ — CCR3, CCR2, CCR8, CCR9, STRL33 («Bonzo»), Gpr 15 («Bob»), Gpr 1, APJ и ChemR23 (Deng, 1997; Liao, 1997).

ВИЧ-1, возможно, также способен связываться с некоторыми интегринами, на­пример, 4 7, нарушая функции клеток и процессы миграции (Arthos, 2008). По некоторым дан­ным, APJ служит корецептором ВИЧ для проникновения в клетки ЦНС. Несмотря на широкий спектр молекул, которые потенциально могут стать корецепторами для ВИЧ-1, основную роль In vivo, По-видимому, играют CCR5 и CXCR4.

Важность CCR5 как основного корецептора для M-тропных штаммов ВИЧ становится видна из следующего наблюдения: большинство людей с дефектным геном CCR5 не восприимчивы к ВИЧ-1 (Liu, 1996). Эксперименты In vitro Показали, что выделенные из крови этих людей T-лимфоциты устойчивы к M-тропным штаммам ВИЧ-1, но остаются восприимчивыми к T-тропным штаммам. У таких людей лимфоциты не экспрессируют на своей поверхности ре­цептор CCR5 вследствие делеции (утери) 32 пар нуклеотидов в гене CCR5.

Во всем мире из­вестно лишь несколько случаев ВИЧ-1-инфекции у людей, гомозиготных по делеции гена CCR5. Неудивительно, что все они были инфицированы T-тропными штаммами ВИЧ-1, ис­пользующими для проникновения в клетку корецептор CXCR4. Эпидемиологические иссле­дования показали, что 10-20% лиц европеоидной расы гетерозиготны по мутантному аллелю гена CCR5 (доля гетерозиготных лиц выше среди выходцев из стран Северной Европы), а го­мозиготны — около 1% лиц европеоидной расы (Dean, 1996).

У жителей Африки и Азии такой делеции гена CCR5 не обнаружено; это говорит о том, что данная мутация возникла уже после разделения человечества на расы в процессе эволюции. У лиц, гетерозиготных по делеции 32 пар нуклеотидов в гене CCR5, снижена экспрессия ре­цептора CCR5 на поверхности клеток; они намного чаще встречаются среди лиц с длительным непрогрессирующим течением болезни, нежели среди лиц с быстрым прогрессированием ВИЧ-инфекции (Dean, 1996). Кроме того, у ВИЧ-инфицированных лиц, гетерозиготных по де­леции 32 пар нуклеотидов в гене CCR5, переход в стадию СПИДа происходит медленнее, лучше ответ на ВААРТ и меньше заболеваемость лимфомами.

Это говорит о том, что плотность ре­цепторов CCR5 на поверхности клетки влияет на скорость репликации ВИЧ не только In vitro, Но и In vivo. Помимо делеции 32 пар оснований гена CCR5 были описаны и другие генетические полимор­физмы рецепторов хемокинов (CCR2) и их промоторов (CCR5), которые влияли на скорость прогрессирования ВИЧ-инфекции. В зависимости от распространенности этих полиморфиз­мов среди пациентов со сходным течением ВИЧ-инфекции, они распределяются на способ­ствующие более быстрому или более благоприятному течению ВИЧ-инфекции (Anzala, 1998; Winkler, 1998). Недавние исследования пролили свет на влияние CCL3L1-CCR5 генотипа не только не прогрессирование ВИЧ-инфекции, но также на ответ на антиретровирусную терапию (Ahuja, 2008).

По-видимому, это зависит не от механизма проникновения ВИЧ в клетку, а от эффективности клеточно-опосредованного иммунного ответа (Dolan, 2007). У больных с быстрым прогрессированием инфекции (быстрым падением количества лимфо­цитов CD4) штаммы, использующие CXCR4 в качестве основного корецептора, выделяются чаще, чем у больных со стабильным количеством лимфоцитов CD4. Экспрессия корецепторов на лимфоцитах CD4 зависит от уровня активации этих клеток.

Рецептор CXCR4 экспрессируется преимущественно на «наивных» T-лимфоцитах, а рецептор CCR5 — на активированных T-лимфоцитах, клетках памяти и эффекторных Т-лимфоцитах. На ранней стадии ВИЧ-1-инфекции преобладают M-тропные штаммы ВИЧ. Примечательно, что M-тропные штаммы ВИЧ передаются чаще независимо от того, какие штаммы — T-троп­ные или M-тропные — преобладают у источника инфекции.

Пока неясно, обусловлено это из­бирательным транспортом M-тропных штаммов дендритными клетками подслизистого слоя или благоприятным содержанием хемокинов и цитокинов в окружающей среде для размноже­ния M-тропных вирусов. Привлекает внимание гипотеза о том, что благодаря размножению в макрофагах M-тропным вирусам легче ускользнуть от иммунной системы, чем T-трогшым, что дает им преимущество в выживании. В связи с этим блокада рецепторов CCR5 представляется перспективным направлением в лече­нии ВИЧ-инфекции (рис.

3.5). Моноклональные антитела к CCR5 (2D7 и другие) In vitro Спо­собны блокировать проникновение штаммов, использующих CCR5 в качестве корецептора, в лимфоциты CD4 и макрофаги. Уже созданы низкомолекулярные блокаторы рецепторов CCR5; в ходе предварительных клинических исзпытаний (см.

главу 6 «АРТ в 2009 году») было проде­монстрировано статистически значимое уменьшение вирусной нагрузки в плазме ВИЧ-инфи­цированных (Fatkenheuer, 2005). Однако результаты исследований In vitro, А также эксперимен­тов на мышах линии SCID (severe combined immunodeficiency [тяжелый комбинированный иммунодефицит]), показали, что подавление штаммов ВИЧ, использующих корецепторы CCR5, может приводить к изменению их тропности в сторону корецепторов CXCR4 (De Clercq, 2001). Рис 3.5.

Технологии защиты клетки от проникновения ОТ5-тропного ВИЧ. Блокада корецепторов CCR5 на поверхности клетки лигандами, которые не являются агонистами (A) или моноклональными антителами (B). Второй путь — уменьшение экспрессии корецептора CCR5 на поверхности клетки с помощью миРНК или интракинов.

Подробнее см. в тексте Низкомолекулярные блокаторы, в том числе T-22, ALX40-4C и AMD3100, способны: блокиро­вать рецепторы CXCR4 (см. главу 6 «АРТ в 2009 году») и в настоящее время проходят доклини­ческие и клинические испытания.

Эффективность других блокаторов CCR5 в лекарственных формах для нанесения на слизистые оболочки изучалась на обезьяньих моделях и, возможно, в будущем такие препараты войдут в арсенал средств для профилактики заражения ВИЧ (Veazey, 2005). Сегодня разрабатываются методы модулирования экспрессии хемокиновых рецепторов. Ин-тракины — это хемокины, которые находятся в цитоплазме и способны связываться со своими рецепторами еще во время транспортировки рецептора к поверхности клетки (Chen, 1997).

«Малые интерферирующие РНК» (миРНК) представляют собой новый молекулярный инстру- мент селективной инактивации генов-мишеней. Двухцепочечная РНК расщепляется фермен­том dicer-1 на короткие части («21-23-меры»). Эти олигомеры могут комплементарно связы­ваться с длинными последовательностями РНК, после чего последние распадаются.

Такая тех­нология в настоящее время применяется в растениеводстве для защиты растений от вирусов. In vitro МиРНК против CCR5 способны предотвратить экспрессию CCR5, а инактивация гена Gag Может эффективно блокировать репликацию ВИЧ (Song, 2005). Хотя применение блокаторов хемокиновых рецепторов кажется перспективным направлением в лечении ВИЧ-инфекции, немало вопросов еще остаются открытыми.

Эксперименты на мышах с инактивированными генами CXCR4 или SDF-1 выявили тяжелые нарушения крове­творения и развития мозжечка (Zou, 1997). Пока неясно, может ли блокада рецепторов CXCR4 привести к нарушениям со стороны каких-либо органов или систем у детей или взрослых.